Aspetti tecnici delle procedure di ricerca ed identificazione degli anticorpi

La procedura più sensibile per la ricerca di anticorpi irregolari è quella che prevede l'impiego di un pannello cellulare costituito da cellule di 2 o 3 donatori opportunamente selezionati e cimentati singolarmente; la procedura perde infatti di sensibilità se le emazie dei diversi donatori vengono mescolate. Cimentando il siero con gli eritrociti scelti in tal modo si avrà la certezza che non vi è una diluizione dei vari antigeni, che potrebbe determinare la mancata evidenziazione di anticorpi deboli.

La selezione di cellule omozigoti per determinati antigeni rappresenta un altro metodo per incrementare ulteriormente la sensibilità della procedura.

Alcuni anticorpi come gli anti-c, anti-Jk^a ed anti-M, che reagiscono con maggiore intensità quando vengono impiegate cellule omozigoti, possono addirittura non reagire con cellule eterozigoti.

Questo comportamento sierologico (reazione più intensa con cellule omozigoti) viene definito "effetto di dose".

L'impiego di diverse metodiche che prevedono differenti condizioni sperimentali rappresenta un ulteriore sistema per incrementare la sensibilità della procedura di ricerca di anticorpi.

I test eseguiti a temperatura ambiente non sono essenziali; qualora vengano eseguiti devono essere letti dopo centrifugazione immediata.

Devono invece essere considerati essenziali i test che prevedono l'incubazione a 37°C in quanto gli anticorpi capaci di reagire con le emazie a questa temperatura in vitro sono generalmente in grado di distruggere le cellule corrispondenti in vivo.

Prima di procedere al test dell'antiglobulina la miscela siero/cellule deve essere incubata in soluzione fisiologica o in soluzioni potenzianti quali quella a bassa forza ionica.

Poiché ciascuno dei mezzi di reazione risulta ottimale a seconda dell'anticorpo considerato, è consigliabile impiegare diverse metodiche. Gli anticorpi di classe IgM generalmente sono in grado di agglutinare le emazie sospese in soluzione fisiologica. Alcuni anticorpi di classe IgG (soprattutto quelli appartenenti al sistema Rh) agglutinano le emazie sospese in albumina; altri anticorpi di classe IgG non agglutinano le emazie ma sono in grado di sensibilizzarle quando siano sospese in soluzione fisiologica, albumina o soluzioni a bassa forza ionica.

I diversi mezzi in cui vengono sospese le emazie condizionano la velocità e la quantità di anticorpo che reagisce.

Per ottenere una sensibilità ottimale nei test di ricerca di anticorpi deve essere impiegato un siero antiglobuline ad ampio spettro, in grado di riconoscere sia le molecole IgG sia il complemento: la distruzione in vivo delle emazie può essere determinata o dalla sensibilizzazione con anticorpi IgG o dall'attivazione del complemento sulle membrane eritrocitarie determinata dagli anticorpi di tipo IgG e IgM.

Il conoscere la specificità e le caratteristiche sierologiche di un anticorpo è indispensabile per la valutazione della sua importanza clinica.

Per caratterizzare ed arrivare alla determinazione della specificità di un anticorpo devono essere condotte indagini a varie temperature e con metodiche differenti, condizionate dal comportamento mostrato nei test di screening. Nel procedere all'identificazione è comunque consigliabile procedere con l'esecuzione, la lettura e la registrazione di tutte le fasi.

La procedura di identificazione degli anticorpi deve includere almeno una metodica che preveda l'impiego di uno dei mezzi potenzianti la reazione ed il test dell'antiglobulina.

L'impiego dell'albumina risulta particolarmente utile nelle procedure di identificazione, in quanto potenzia l'agglutinazione a 37°C soprattutto quando sono presenti anticorpi del sistema Rh.

Si deve sospettare la presenza di anticorpi freddi quando l'intensità della reazione diminuisce con il crescere della temperatura o se l'agglutinazione nella fase dell'antiglobulina è più debole di quella osservata in fisiologica a 37°C. In questi casi i test devono essere condotti in duplicato con incubazioni a diversa temperatura. Un test va eseguito senza aggiunta di potenziatori con incubazione a temperatura ambiente ed un altro, allestito con l'aggiunta di soluzione potenziante, viene incubato a 37°C e seguito dal test dell'antiglobulina.

Per garantire la validità delle procedure di identificazione degli anticorpi, i risultati ottenuti in ciascun test vanno valutati per l'agglutinazione o per l'emolisi ed i risultati accuratamente registrati.

Le ragioni per cui deve essere registrata l'intensità delle reazioni sono duplici. Innanzitutto, le variazioni di intensità di reazione possono indicare la presenza di anticorpi di diversa specificità e l'eventuale osservazione di una più intensa reazione con le emazie omozigoti indicherebbe la presenza di anticorpi con effetto di dose, rappresentando questa caratteristica un importante parametro nel riconoscimento della specificità.

Poiché il giudizio sull'intensità della reazione è molto soggettivo è importante standardizzare i criteri di lettura in modo che le letture eseguite da un tecnico possano essere interpretate anche da altri componenti del laboratorio.

Prima di procedere alla valutazione dei risultati ottenuti con le emazie del pannello si deve osservare accuratamente il risultato ottenuto cimentando il siero del paziente con le sue proprie emazie (controllo autologo). Questo controllo, per essere valido, deve essere eseguito impiegando le stesse metodiche e gli stessi reagenti usati per le emazie del pannello e deve essere allestito in parallelo con ciascuno dei pannelli. Se l'autocontrollo è negativo serve come valore di riferimento per le letture con le cellule del pannello. Risulta soprattutto utile quando le reazioni con il pannello sono molto deboli.

Se l'autocontrollo è positivo è importante confrontare la differenza dell'intensità delle reazioni con le cellule del pannello nei diversi test ed alle differenti temperature.

Indipendentemente dalle procedure impiegate, l'identificazione di un anticorpo singolo risulta discretamente agevole.

L'identificazione emerge immediatamente confrontando la disposizione dei risultati positivi con il profilo antigenico delle emazie di un pannello "Antigramma".

Un parametro importante da considerare, in quanto può fornire utili indicazioni sulla specificità, è il mezzo di reazione con cui l'anticorpo in esame reagisce in modo ottimale. Tuttavia la condizione indispensabile per il riconoscimento della specificità è rappresentata dalla reazione stessa, in quanto se è vero che anticorpi di alcune specificità generalmente reagiscono in modo ottimale in determinate condizioni sperimentali, questo soffre di notevoli eccezioni.

Quando è presente un singolo anticorpo la specificità rilevata dalle reazioni positive con il pannello risulta facilmente definibile. Tuttavia prima di trarre conclusioni definitive si consiglia di controllare accuratamente se quella disposizione di risultati positivi può essere compatibile con altre possibili specificità (con pannelli ben preparati è relativamente raro che ciò possa accadere).

Un mezzo semplice per escludere la presenza di altri anticorpi è quello di segnare tutti gli antigeni presenti nelle emazie del pannello che hanno fornito un risultato negativo. Se tutti gli antigeni significativi sono stati segnati, ad eccezione di quello corrispondente all'anticorpo già segnalato in precedenza, viene confermata quella specificità e la probabilità che sia presente un secondo anticorpo è relativamente scarsa.

Per evitare di trarre conclusioni errate dovrebbero essere segnati solo gli antigeni presenti allo stato omozigote. In caso contrario quegli anticorpi con un effetto di dose tanto marcato da non reagire con l'antigene presente in singola dose potrebbero venire erroneamente esclusi.

Dopo aver proceduto all'identificazione con l'Antigramma la conferma prevede la tipizzazione delle emazie del soggetto in esame per l'antigene corrispondente. Ciò viene eseguito con antisieri commerciali o con sieri selezionati nel laboratorio, rispettando la compatibilità per il gruppo AB0 tra i sieri proposti e le emazie in esame.

Alcuni anticorpi vengono prodotti più frequentemente di altri, a seconda dell'immunogenicità dell'antigene considerato, della sua frequenza nella popolazione, della quantità e della via di somministrazione dell'immunogeno.

La frequenza con cui i vari anticorpi sono stati evidenziati varia nei diversi studi eseguiti soprattutto per la diversa composizione della casistica considerata. Ad esempio i pazienti ospedalizzati sono mediamente più vecchi e potenzialmente sono stati esposti a stimoli antigenici per trasfusioni o gravidanze pregresse, mentre ciò è meno probabile che avvenga per i donatori di sangue, che sono verosimilmente meno immunizzati. Inoltre, alcuni di questi studi sono stati eseguiti in laboratori di riferimento e pertanto la particolare specializzazione del personale può in qualche modo influenzare i risultati ottenuti sui campioni esaminati. Infatti le metodiche impiegate nella ricerca condizionano il tipo di anticorpi evidenziati. Ad esempio l'uso di prolungate incubazioni a temperatura ambiente fa sì che vengano evidenziati con facilità anticorpi freddi, l'impiego degli enzimi proteolitici consente di evidenziare un maggior numero di anticorpi anti-E ed anticorpi del sistema Lewis che non vengano riconosciuti adottando metodiche diverse.

Gli anticorpi anti-I e anti-IH, sono autoanticorpi freddi di nessuna importanza clinica ad eccezione che nei casi di malattia da agglutinine fredde in cui gli anticorpi, generalmente di specificità anti-I possono essere responsabili di lisi cellulare «in vivo- quando il paziente si trovi in ambiente freddo.

Come evitare gli errori di identificazione degli anticorpi

è teoricamente possibile che la distribuzione dei risultati positivi nell'ambito del pannello cellulare sia casuale e non attribuibile alla specificità sospettata. Nel processo di identificazione degli anticorpi è accettato un limite di confidenza del 95% il che significa la probabilità di 1 su 20 che le reazioni siano casuali. Questo livello di probabilità viene rispettato quando tre cellule che posseggono l'antigene reagiscono e tre che non lo posseggono forniscono risultato negativo. Se sono presenti solo due cellule che posseggono l'antigene e reagiscono positivamente devono essere presenti almeno 5 non reattive; se solo 1 cellula è reattiva devono essere presenti 19 non reattive. Un pannello a 7-8 cellule può essere adeguato a fornire questi limiti di confidenza quando nel siero in esame è presente un anticorpo singolo e qualora altre specificità non vengano mascherate dalle reazioni positive. Le miscele di anticorpi tuttavia sono molto frequenti e per questo motivo è indispensabile disporre di pannelli cellulari di almeno 10-12 cellule. Se il numero di cellule a disposizione non è sufficiente, la specificità sospettata deve essere confermata con altri sistemi, per esempio la neutralizzazione dell'anticorpo con la sostanza gruppospecifica o la distruzione dell'antigene con trattamento enzimatico.

Se la distribuzione delle reazioni non corrisponde a nessuna specificità comune è più probabile che si tratti di una miscela di anticorpi comuni piuttosto che di un anticorpo solo con specificità rara. Miscele semplici di anticorpi sono generalmente di facile identificazione se si considera che la miscela è il più delle volte costituita da quegli anticorpi che più frequentemente vengono riscontrati da soli. Ad esempio, nei soggetti Rh negativi, l'anticorpo anti-D è spesso accompagnato da anticorpi anti-K, anti-Fy^a o da anti-P_r Esiste un'importante eccezione a quanto detto: l'anticorpo anti-C, molto raro come anticorpo singolo, è invece molto frequente in associazione con l'anticorpo anti-D.

Nei soggetti Rh+ le più comuni associazioni sono: anti-E e anti-K, anti-K più anti-Fy^a; anti-E più anti-Fy^a; anti-c più anti-K ecc.

Nonostante un anticorpo singolo o una miscela semplice possano essere facilmente identificati, vi sono tuttavia alcuni fattori che possono generare confusione:

• anticorpi di una data specificità non sempre reagiscono nel modo previsto, per quanto riguarda il mezzo di reazione e la temperatura;

• un anticorpo singolo con effetto di dose può simulare la presenza di una miscela;

• anticorpi molto deboli possono non reagire con tutte le cellule che posseggono l'antigene, soprattutto se si tratta di un anticorpo che mostra un effetto di dose o di un antigene che possa mostrare una variabile espressività;

• miscele complesse sono di difficile identificazione.